@KIN統計解析Webサービス ユーザーマニュアル
No.1
解析に使用する菌叢解析データファイルの準備
■ S-KIN PROおよびCOMA PROの解析結果Reportフォルダに含まれる“06_data_frame“フォルダ内に記録された”data_frame_2_species.tsv“ファイルを用意します。Reportのフォルダは解析結果として送付されたCD-R/DVD-R内に"～Microbiome"といった名前のフォルダとして保存されています。
■ もしくはMetagenome@KINの解析結果に含まれる“06_data_frame“フォルダ内の”data_frame_2_species.tsv“ファイルも使用可能です。
No.2
解析Webサイトへのデータファイル入力
(1) “データファイルを選択…”をクリックして”data_frame_2_species.tsv“ファイルを入力します。
(2) タブ区切りテキストを入力した場合、ワークシート選択は”Default”を選択します。
エクセルファイルの場合は菌叢データの含まれたシートを選びます。
No.3
グループ設定ファイルの入力の準備（作成）
■ 事前にエクセル上で以下のようなグループ設定ファイルを作成します。
■ Lefseを除く統計解析はグループ間の比較として実施されるため、１つの項目に少なくとも2つのグループを設定します。グループが無記載の検体やNAと表記された検体は当該項目における統計解析から除外されます。
■ 統計解析の実行には1グループあたり最低3検体を割り振る必要があります。
１つの項目に3つ以上のグループを設定した場合、グループ間の総当たり比較解析を実施します。
注意；グループ設定ファイルのA列に表記されるサンプル名と菌叢解析データファイル(data_frame_2_species.tsv)の1行目にあるサンプル名は一致している必要があります、並び順の違いは異なっていても問題になりません。
No.4
グループ設定ファイルの入力
■ Step2:グループ指定ファイル選択”タブをクリックしてグループ設定(エクセル)ファイルを入力します。
(1) 作成したグループファイルを選択します。
(2) グループ設定が記載されたシートを選択し、どの項目のグループ情報を利用するかを選択します。
×をクリックすると、その比較グループの組み合わせを統計解析から除去します。
■ Lefse解析ではグループ間の比較の組み合わせに関わらず、設定されたすべてのグループ其々に特徴となるマーカー細菌を同定します。
No.5
解析条件の設定
■ Step3:前準備と計算設定”タブをクリックして以下の2点の設定を行います。
(1) α多様性指数のグループ間統計解析に使用する多様性指数をShannon indexもしくはSimpson’s indexから選びます。
(2) PERMANOVAによるβ多様性解析時に使用するGuide Tree(菌種間の配列距離)を選択します。選択するGuide Treeは解析に使用されたTaxonomyデータベースと同名の物とします。
(3) Unweighted Unifracでは希少な菌種が比較的重視され、Weighted(0.0,0.5,1.0) Unifracでは検体中で豊富に存在する菌種が重視されます。
(4) Lefse解析を同時に実行する場合はチェックを入れます
■ 現在のS-KIN/COMA PRO解析では16sMicrobial r228(NCBI Genbank r228準拠)もしくは16sMicrobial r202311のいずれかのTaxonomyデータベースが使用されており、解析に使用されたデータベースは解析報告書の「2, Blastによるリードへの菌種割り当て」に表記されています。
■ 最後に“計算実行”ボタンをクリックします。
「辞書で対応がつけられない生物種名」と「GuideTreeで未定義の～」項目に表示される生物種は、入力された菌叢解析データファイルと解析システム内のデータベース間で菌種名が一致しない生物種を示し、PermanovaおよびLefse解析からは除外されます。数十菌種以上が表示される場合、“計算に利用するGuideTree”の選択が誤っている可能性があります。
No.6
解析結果の取得
表示された解析結果ページから各解析結果の記載されたタブをクリックして結果を閲覧取得します。解析結果はブラウザを閉じると削除されます、結果データを一括取得したい場合は、解析結果ページ右上の”処理結果ファイルダウンロード”リンクをクリックします。
No.7
β多様性(Beta Diversity)解析結果
■ UniFrac解析結果：計算条件には、当該解析結果ページで表示されている解析方法と2群間比較に用いられた2つのグループが示されます。
(1) Pr(>F):”F検定のP値“と呼ばれ、0.05未満の場合に2つのグループ間で菌叢構造に差があると判断します。
(2) 散布図上の楕円は95%信頼楕円を示します。
No.8
α多様性(Alpha Diversity)解析結果
■ Kruskal-Wallis検定により2群間の多様性指数に有意な差があるかを検定しているため、P-valueはMann-Whitney U 検定のP値と一致します
No.9
マーカー細菌探索(LEfse)結果
■ LEfse解析は設定した2つ以上のグループの違いを説明する、各グループに特徴的なマーカーとなる細菌を同定する解析手法です。
■ グループの設定を2群とした場合の結果と3群以上を設定した場合で出力される図が異なります。
■ LDA SCOREが2以上となった有意なマーカー細菌がグラフと共に表示されます、菌名は種階層のみならず属以上の分類階層も表示されます。LDA SCOREが2以上となった菌や階層が存在しない場合は図が表示されません。
